菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)属鲀形目(Tetraodontif-ormes)、鲀科(Tetraodontidae)、东方鲀属(Takifugu),是一种温带近海底层鱼类,其肉质细腻、味道鲜美,而且生长速度快、售价高,在中国被认为是价值突出的鱼类养殖品种[1]。但菊黄东方鲀抗病力较弱,因而在养殖过程中常需使用兽药对其进行疾病预防。呋喃西林是一种广谱抗生素,具有良好的抗菌效果,早期常被用于水产动物、猪、牛、家禽等养殖过程[2⇓-4]。而研究发现,硝基呋喃类药物及其主要的代谢产物对人体具有致畸、致癌、致突变的作用,严重影响人的身体健康[5⇓⇓⇓-9]。因此,农业农村部公告第250号[10]规定的食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单包括呋喃西林(Furacilinum)、呋喃妥因(Furadantin)、呋喃它酮(Furaltadone)、呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃苯烯酸钠(Nifurstyrenate sodium)5种硝基呋喃类药物。但因价格便宜、抗菌效果显著,硝基呋喃类药物在水产养殖过程中被违规使用的情况[11⇓-13]时有发生。近年来,科研人员投入大量的精力开展硝基呋喃类药物在水产品中的代谢残留规律研究及残留量检测工作[14⇓⇓⇓⇓-19],保障中国水产品的质量安全。目前,关于呋喃西林代谢物在水产动物体内残留消除规律的研究主要集中在虾[20⇓-22]、蟹(Eriocheir sinensis)[23-24]、海参(Apostichopus japonicus)[25-26]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[27]、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[28]等鱼类[29-30],但是关于呋喃西林代谢物在菊黄东方鲀体内的残留与消除规律的研究未见报道。
本研究在已有文献和相关标准的基础上,以菊黄东方鲀为研究对象,模拟实际养殖中全池泼洒的给药方式,研究呋喃西林代谢物氨基脲(Semicarbazide,SEM)在菊黄东方鲀体内的残留与消除规律,评估使用呋喃西林后的代谢物SEM在菊黄东方鲀体内的残留风险,为河鲀鱼的安全健康养殖及质量安全风险评估提供科学的数据支持。
1 材料与方法
1.1 试剂与设备
SEM标准品(CH5N3O,纯度>99.0%,德国Augsburg公司);内标SEM-13C-15N2标准品(13CH6ClN15N2O,纯度>99.0%,德国WIETGA公司);2-硝基苯甲醛(纯度>98.0%,美国Sigma公司);乙酸乙酯、正己烷、甲酸、甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);乙酸铵、盐酸、磷酸氢二钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。
TSQ Quantum Ultra液相色谱-串联四级杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司);Hypersil Gold C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm,3.0 μm,美国Thermo公司);AB204-E电子分析天平(精密度0.1 mg)、ME203E电子分析天平(精密度0.001 g,Menler Toledo公司);SHA-B水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司);MS3旋涡混合器(德国IKA公司);DT5-5低速离心机(北京时代北利离心机有限公司);HSC-24B氮吹仪(广州智真生物科技有限公司);Milli-Q纯水机(法国Millipore公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 养殖条件
实验地点为福建省水产研究所水产养殖实验基地,养殖水体体积为20 m3,时间:12月—翌年3月。实验用健康的菊黄东方鲀共计200尾,平均体质量约为250 g。实验前,先对菊黄东方鲀进行暂养,正常投喂空白饲料,两周后挑选体色、活力均正常的健康菊黄东方鲀进行实验。
1.2.2 实验设计与采样
实验分为1组空白对照组和2组平行给药组,每组约有菊黄东方鲀70尾。经检测,实验用鱼投药前未检出SEM。根据养殖过程中的菊黄东方鲀实际情况,对于给药组,每组称取10.0 g呋喃西林原粉,先用养殖水对其进行一定的溶解后,再进行全池泼洒,使养殖池中呋喃西林溶液理论浓度为0.5 mg/m3。于给药后第8天对养殖池进行换水。给药后第1、2、4、6、8、10、13、16、19、23、27、34、41、48、52、62和77天的上午9点进行样品采集,每批次样品至少采集3尾,去皮并处理取得肌肉部分,匀浆后将样品分成3份,于-20 ℃冰箱中冷冻保存,一周内进行检测。空白对照组不给药,采样方法同给药组。所有组别的养殖条件均一致,实验周期为77 d。
1.2.3 样品前处理
样品前处理参考GB 31656.13—2021《食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》[31]中的方法。
1.2.4 色谱条件
流动相:A为0.02%甲酸水溶液,含5 mmol/L乙酸铵;B为0.02%甲酸甲醇溶液。流动相梯度洗脱程序如表1所示。
表1 流动相梯度洗脱程序
Tab.1
| 时间/min Time | A/% | B/% |
|---|---|---|
| 0 | 80.0 | 20.0 |
| 1.00 | 80.0 | 20.0 |
| 2.00 | 10.0 | 90.0 |
| 7.00 | 10.0 | 90.0 |
| 7.50 | 80.0 | 20.0 |
| 12.50 | 80.0 | 20.0 |
注:A.甲酸/水(V/V=0.02%),含5 mmol/L乙酸铵;B.甲酸/甲醇(V/V=0.02%)。
Notes:A indicated formic acid/water (V/V=0.02%),containing 5 mmol/L ammonium acetate;B indicated formic acid/methanol (V/V=0.02%).
1.2.5 质谱条件
离子源:电喷雾离子源,正离子模式;喷雾电压:3.0 kV;毛细管温度:350 ℃;蒸发室温度:220 ℃;鞘气压力:3.0×105 Pa;辅助气压力:6.6×104 Pa;碰撞气压力:0.20 Pa。
质谱参数:SEM离子对209/166,碰撞能量11 eV;离子对209/192,碰撞能量13 eV;离子对212/168,碰撞能量11 eV。
1.2.6 标准曲线
分别准确称取10.0 mg SEM和SEM-13C-15N2,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成100 μg/mL标准储备液和100 μg/mL内标储备液,于-20 ℃冰箱中避光存放;再经稀释,分别配制成质量浓度为100 ng/mL标准工作液和100 ng/mL内标工作液。于50 mL离心管中分别加入10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μL标准工作液,同时加入100 μL内标工作液,按照1.2.3方法进行处理,配制得到的SEM质量浓度为1.0~40.0 ng/mL、内标质量浓度为10.0 ng/mL的系列标准溶液,待上机测定。以SEM的质量浓度为横坐标,SEM与SEM-13C-15N2的峰面积比为纵坐标,得到线性回归方程和相关系数。
1.2.7 加标回收率
在空白的菊黄东方鲀肌肉样品中,分别加入100 ng/mL SEM标准溶液10.0、50.0 μL(相当于SEM在肌肉中的质量分数为0.50、2.50 μg/kg),避光放置至少30 min,使SEM渗入肌肉组织。每个加标浓度作3个平行样,按照1.2.3方法进行处理,经上机测定求得该方法的平均回收率和相对标准偏差。
1.2.8 数据处理(药时曲线)
通过上机测定得到每批次样品中SEM的含量,以采样时间为横坐标、SEM含量平均值为纵坐标,采用Excel 2013处理,得到菊黄东方鲀肌肉中SEM的药时曲线。
2 结果与分析
2.1 线性回归及回收率
在实验设置的色谱和质谱条件下,对系列浓度的SEM标准溶液进行测定,可得SEM标准品的选择离子流图,图1为20.0 ng/mL SEM标准溶液的选择离子流图。以SEM和内标SEM-13C-15N2的峰面积比值(Y)对SEM质量浓度(X,ng/mL)作线性回归,SEM在系列浓度范围内线性关系良好,标准曲线方程为:Y=0.172X-3.94×10-2,R2=0.999 7。同时以空白的菊黄东方鲀样品为研究对象,考察加标回收率和精密度,得到菊黄东方鲀空白样和加标样品的选择离子流图(图2)。结果表明,在加标量为0.50 μg/kg时,样品平均回收率为112%,相对标准偏差为6.19%;在加标量为2.50 μg/kg时,平均回收率为89.2%,相对标准偏差为3.26%。本研究采用的高效液相色谱-串联质谱法的精密度和准确度满足水产品中硝基呋喃类代谢物残留量检测的要求。
图1
图1
SEM 标准品衍生产物选择离子流图
Fig.1
Selected reaction monitoring chromatograms of the derivative of SEM standard
图2
图2
鱼肉空白样品(A)和加标样(B)选择离子流图
Fig.2
Selected reaction monitoring chromatograms of blank fishes sample (A) and spiked fishes sample (B)
2.2 SEM在菊东方鲀肌肉中的残留量及消除规律
采用实验选取的处理方法和仪器条件,对不同时间点采集的样品进行SEM残留量的测定,得到硝基呋喃代谢物的药时曲线如图3所示。由图可知,在泼洒呋喃西林溶液后,SEM在菊黄东方鲀肌肉中呈现出较强的蓄积能力,1 d后菊黄东方鲀肌肉中检出SEM的含量为4.50 μg/kg;到第4天,SEM的残留量逐渐升高至峰值35.0 μg/kg;之后,SEM的残留量开始下降,到了第6天迅速下降至15.0 μg/kg,随后达到平衡状态,消除速率趋于平缓;21 d后,SEM残留量维持在9.00~12.0 μg/kg的浓度水平;35 d后SEM残留量开始出现比较明显的降低,但消除速率缓慢;直至第77天实验结束时,肌肉中的SEM质量浓度还有约2.50 μg/kg,仍高于5倍检出限(0.50 μg/kg)。
图3
图3
菊黄东方鲀肌肉中SEM药时曲线
Fig.3
The curve of SEM concentrations-time in the muscle of T. flavidus
3 讨论
3.1 SEM在菊东方鲀肌肉中的残留量趋势分析
呋喃西林泼洒到池塘后,菊黄东方鲀肌肉中SEM含量的达峰时间、峰浓度值是反映药物在机体内消除规律的重要参数。在实验的前期阶段,菊黄东方鲀肌肉中SEM的残留量呈现随时间的延长显著增加并达到最高值(第4天)再波动降低的趋势(图3)。这是因为在泼洒药物后,呋喃西林原药一部分在养殖水体中降解为SEM[28],一部分则通过被菊黄东方鲀的皮肤、鳃、饮食等不同方式进行吸收或渗透,在体内代谢为SEM,从而使鱼体内的SEM含量升高。相关研究表明,呋喃西林原药在养殖水体中1 d内即降解为SEM[28],而进入水生动物体内后,在几小时内就迅速代谢为SEM[22-23,25]。而根据药时曲线,菊黄东方鲀肌肉中SEM含量是逐渐升高的,在第4 天左右才达峰,而不是在第1 天。因此,推测在给药后的0~4 d内,鱼体除了自身吸收原药代谢产生的SEM外,同时也在不断吸收环境中的SEM,从而导致肌肉中SEM含量的累积。而第6天的迅速降低,可能是鱼体自身的代谢和排泄导致的。在给药第8天换水后,肌肉中SEM含量并没有明显的下降,反而有少量上升的趋势,由此可见,到消除阶段后期,养殖水体对肌肉中SEM含量的累积并没有明显的影响。根据索纹纹等[28]的研究结果,在水体中的SEM刚开始时消除速率较快,随后趋于平缓并慢慢降至检出限以下。这可能是养殖水体不再影响肌肉中SEM累积的原因所在。在第8~48天,SEM含量虽然整体上是下降的趋势,但是有三次出现回升,这可能是SEM含量在体内降低至一定程度后达到了相对平衡,与环境互相循环所致。
3.2 SEM在菊东方鲀肌肉中的消除规律分析
给药后,菊黄东方鲀体内的SEM开始累积,并在短时间内达到峰值,随后开始消除,几天内迅速降低至一个较低的残留浓度,之后消除缓慢,给药77 d后,SEM的残留浓度仍高于5倍检出限。这与SEM在其他水产品中残留规律的相关研究结论相似,如丁军伟等[2]采用投喂的方式对SEM在青石斑鱼(Epinephelus awoara)肌肉中的消除规律进行研究,发现消除163 d后,SEM在青石斑鱼肌肉中的含量仍高于检出限;谭志军等[27]在研究呋喃西林和呋喃唑酮代谢物在大菱鲆组织中的消除规律时,采用药浴的方式给药185 d 后,大菱鲆体内SEM的残留量仍高于检出限;索纹纹等[28]采用全池泼洒的方式,研究环境中氨基脲消解规律及评估其在斑点叉尾鮰肌肉中的残留,发现SEM需要270 d才能完全被消除。结果说明,虽然给药方式不同,但是SEM在不同鱼类中的残留时间均较长,这可能是因为SEM能与细胞膜蛋白稳定结合,而导致消除速率较慢[23]。
4 结论
本实验研究了在全池泼洒的给药方式下,呋喃西林代谢物SEM在菊黄东方鲀肌肉中的残留消除规律。直至实验结束,菊黄东方鲀肌肉中的SEM仍未被消除至检出限以下,可见SEM在菊黄东方鲀体内的消除时间较长。因此在实际的水产养殖过程中,应严格禁止呋喃西林药物的使用。本实验的研究结果可为河鲀鱼的健康养殖提供科学的数据支持,也有利于相关管理部门对水产养殖过程中呋喃西林使用情况的严格监控,进一步加强排查和监测,从而保证水产品的质量安全。
参考文献
三种生物保鲜剂结合冷藏对菊黄东方鲀的保鲜效果
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为了研究生物保鲜剂对菊黄东方鲀品质的影响，以菌落总数、挥发性盐基氮及汁液流失率为指标，探讨在4℃贮藏条件下，不同生物保鲜剂（茶多酚、乳酸链球菌素以及溶菌酶）处理对菊黄东方鲀品质的影响。结果表明，在贮藏10 d时，0.5%浓度茶多酚组的菌落总数为4.71 lg(CFU/g)，TVB-N值为12.82 mg/100 g，汁液流失率为6.12%。在贮藏15 d时，0.2%浓度乳酸链球菌菌落总数仅为4.44 lg(CFU/g)，TVB-N值为13.16 mg/100 g，汁液流失率为6.91%。在贮藏10 d时，0.3%浓度溶菌酶组的菌落总数为4.68 lg(CFU/g)，TVB-N值为13.25 mg/100 g，汁液流失率为4.47%。空白组在贮藏10 d时的菌落总数达到5.52 lg(CFU/g)，显著高于其他保鲜剂处理组（P<0.05）。空白组汁液流失率显著低于保鲜剂组。结论：0.5%茶多酚、0.2%乳酸链球菌素及0.3%溶菌酶均对菊黄东方鲀的保鲜效果最佳。
基质分散固相萃取与液相色谱-串联质谱联用法检测淡水鱼中硝基呋喃类代谢物的残留量
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水产品中孔雀石绿、硝基呋喃、氯霉素残留免疫胶体金前处理过程的探讨
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表1
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